塑料由于重量轻、延展性好、高透明度和高硬度，被大量生产并广泛应用于纺织和包装行业。1950年，全球每年生产塑料约为200万吨；截至2015年，已产生约63亿吨塑料垃圾，其中约9%被回收，12%被焚烧，剩余79%被堆积在垃圾填埋场或自然环境中。
塑料的过度消耗使用和不完善的回收管理措施导致了严重的塑料/微塑料污染问题，给生态系统带来了重大负担，并对人类健康造成了严重威胁。作为全球使用最广泛的塑料之一，聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）因其优异的化学稳定性和机械性能脱颖而出。
然而，由于PET酯键和芳香核固有的化学惰性，带来了巨大的降解挑战。我国每年约2400万吨废弃涤纶（PET含量大于85%）待有效处理，以期免于污染环境。
目前的PET处理方法，包括填埋、焚烧、机械和化学处理，这些工艺均会对环境造成严重污染，并需要大量能源消耗。生物催化剂具有在温和的工艺条件下高选择性的优势，通过生物催化剂将PET回收到其单体并进行再聚合，被广泛认为是PET回收处理的理想且环保的解决方案。但生物技术回收PET对于实现工业化仍存在技术和成本障碍。
如图1所示，传统的生物技术主要由三部分组成：1、预处理（培养基的制备和杀菌）；2、发酵培养；3、产物纯化。
第1部分中，传统的微生物培养易受杂菌污染，因此需要复杂的高压杀菌设施，能耗巨大。此外，还需要消耗大量淡水资源配置培养基为工程菌提供养分。
第2部分中，通常添加抗生素以进一步避免污染（这可能加速耐药菌株的出现）。此外，由天然PET降解微生物（例如i.sakaiensis）产生的PET水解酶的表达水平通常不足以满足工业需求，因此需要开发有效的重组表达系统来降低生产成本。
第3部分中，由于PET水解酶通常在碱性条件下表现出最佳的PET降解活性， PET被降解为可溶性对苯二甲酸盐（如Na2TPA），然后通过酸化沉淀获得对苯二甲酸（TPA）。具体而言，1kg的废弃PET降解并通过HCl酸化可获得0.865 kgTPA，同时产生的废水将含有至少0.609kg的NaCl。直接排放酸化产生的大量含盐废水可能造成废水二次污染和副产物资源浪费。
在此，为了解决传统生物工艺中的微生物污染、高能耗、高淡水消耗和低产量问题，以及PET酶水解过程中TPA纯化产生的含盐废水问题，基于团队已有的科研成果（可产业化的高性能酶组装体和废弃PET酶法再生的全流程工艺），本研究旨在开发一种经济高效、绿色环保的PET生物降解工艺。基于宿主筛选和副产物循环（图1），新工艺提供了一种有效的方法来解决与传统PET生物回收相关的挑战。
具体的，新工艺在预处理和发酵步骤中，选择快速生长的嗜盐V. natriegens作为底盘细胞。一方面，V. natriegens在高盐环境中培养可以有效地防止其他微生物污染，从而减省了高压灭菌环节。此外，新工艺可以使用海水代替淡水资源在非灭菌环境中发酵培养，简化了生产过程，减少了能源和淡水消耗。
不仅如此，快速生长的V. natriegens可以提高PET水解酶的表达量，从而降低生产成本。在产品纯化步骤中，TPA纯化产生的含盐废水被重新用于培养V. natriegens，避免了副产品浪费，并最大限度地减少了二次污染。新工艺基于宿主筛选和副产物回收，具有高效、经济、节能、环保的优点，适用于实现工业规模的PET生物降解。
Fig. 1 Flow chart for the traditional PET biodegradation process and the new processes
新工艺中需钠弧菌（V. natriegens）的高效蛋白表达能力
由于快速的生长速度和丰富的核糖体数量，新型宿主V. natriegens表现出优异的生物合成速率和蛋白质表达能力。两种不同的高活性PET水解酶（IsPETasePA突变体和LCCICCG突变体）都成功地在V. natriegens中可溶性表达（图2）。与大肠杆菌相比，V. natriegens表现出更高的蛋白质表达水平，这可能归因于在相同的诱导条件下V. natriegens的生长速度更快。IsPETasePA突变体和LCCICCG突变体的蛋白质表达量分别增加了87.3%和65.8%。
对于PET生物降解，来自两个不同宿主的IsPETasePA和LCCICCG随着时间的推移对PET的降解作用均相似，这表明利用V. natriegens表达蛋白质不会影响酶的活性和稳定性，进一步表明V. natriegen作为表达PET水解酶的高效宿主的潜力。
Fig.2 Comparative analysis of protein expression levels and enzyme activity of PET hydrolase expressed in V. natriegens and E. coli. (a) SDS-PAGE of IsPETasePA and LCCICCG expressed by V. natriegens and E. coli; (b) protein expression quantity of IsPETasePA and LCCICCG expressed by V. natriegens and E. coli; (c-d) the growth of V. natriegens during heterologous expression of PET hydrolase: (c)before the addition of IPTG; (d) after the induction of 24 h. (e-f) the effect of PET enzymatic hydrolysis by IsPETasePA (e) or LCCICCG (f) expressed in V. natriegens and E. coli.
由于复杂的杀菌过程和高昂的生产成本，目前的工业生物技术在经济上缺乏竞争力。
作为一种嗜盐微生物，V. natriegens需要高盐培养条件，而高盐环境能够有效防止微生物污染。在非无菌和不补充抗生素培养条件下，V. natriegens表现出与无菌条件下相似的PET水解酶表达水平和活性（图3）。另外，海水中含有大约3%的NaCl，适合于为V. natriegens的生长提供高盐条件并节约淡水资源，这突出了V. natriegens具有在海水基培养基的开放培养系统中可持续高效生产PET水解酶的潜力。
Fig.3 The industrial potential of V. natriegens as a heterologous expression host for PET hydrolase. (a,c) Protein quantity and enzyme activity of IsPETasePA (a) or LCCICCG (c) expressed by V. natriegens under non-sterile conditions; (b,d) SDS-PAGE analysis of IsPETasePA (b) or LCCICCG (d) expressed by V. natriegens under non-sterile conditions; (e-f) Protein expression quantity and enzyme activity of IsPETasePA (e) or LCCICCG (f) expressed by V. natriegens cultivating in seawater-based medium under non-sterile conditions.
PET水解酶通常在碱性条件下表现出最佳的PET降解活性，PET被降解为可溶性对苯二甲酸盐，需要通过酸化才能获得TPA，产生大量含盐水废水。
IsPETasePA突变体可以在温和的反应条件下降解PET，并表现出高水平的蛋白质表达，被选择为生物催化剂，以开发一种经济高效且绿色环保的PET生物降解工艺。基于快速生长的嗜盐宿主V. natriegens，新工艺将Na2TPA酸化过程中产生的含盐废水进一步巧妙地重新用作培养基。V. natriegens能够在含盐废水培养基中正常生长，并将IsPETasePA的表达保持在正常水平（图4），因此开发了一种新型废水和副产物循环回收的PET生物降解工艺。
Fig.4 Cultivating V. natriegens and expressing PET hydrolase in saline wastewater-based medium. (a) Growth rate of V. natriegens in LB3 medium and saline wastewater medium; (b) Quantitative analysis of protein expression and (c) SDS-PAGE of V. natriegens cultured in LB3 medium and saline wastewater medium.
此外，在新工艺中以嗜盐菌V. natriegens作为抗污染宿主（图1），有效避免了灭菌带来的巨大能耗（能量减少2.48倍）（表1）。同时，通过高效的蛋白质表达，快速生长的V. natriegens显著降低了化学品成本（发酵产酶成本降低了47.9%，表2）。因此，新的PET生物回收工艺大大降低了PET生物降解的能源消耗和成本投入，凸显了其工业应用潜力。
基于新型底盘细胞V. natriegens的高效表达系统和副产物循环利用的新型工艺具有高效低成本的优势，可助力PET生物法回收产业化发展，实现“白色污染”清洁回收。
图丨相关论文（来源：Bioresource Technology）
本文为源天生物科技（天津）有限公司与天津大学酶工程课题组联合研发成果。
https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S096085242301341X
原文始发于微信公众号（艾邦高分子）：源天生物最新成果：一种具有工业应用潜力的新型PET生物回收工艺
